高通量测序原理(tm值计算公式)

做过分子实验的人都知道，要想做的有效率有质量是很苦逼的，1个月做100个克隆那都是小case，没点看家的本事怎么行。如果再遇到比较极品的稀有基因，周旋个把月，那也是家常便饭。下面就和大家分享一些载体构建的经验，从此迈向科研达人：

1. 准备工作

俗话说：用欲善其事，必先利其器。建议大家在做构建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推荐两个工具，一个是oligo软件，常用于引物设计和酶切位点分析；另一个是DNAstar软件，工具极强大，一款全面的生物医学软件，用作DNA和蛋白质序列分析、重叠群拼接和基因工程管理。

插播个笑话：听说隔壁实验室里有个学医的学生来做课题，很聪明很刻苦，但除了他以外，包括老板在内都是生物物理背景，整个实验室对分子生物就只有一个粗浅的概念，这个学生就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这学生他不懂啊（要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂），自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个突变，要懂的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。他呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，他光测序就要花好几千（你得佩服她老板真有钱呀）。这件事教育我们准备工作是多么重要。

2. 设计引物

1) 注重要：看懂质粒图谱！拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。

想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了；C1质粒，注意阅读框，要是移码了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚别弄窜了。一句话，要看懂你的图谱！

其他需要注意：

• 设计酶切位点时要加保护碱基（大家要用T载体就当我没说）;
• 酶切位点设计原则：尽量用粘性末端，实在不行就用一些常用平端酶，如EcoRV和SnaB1等，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM值的时候要减去这些不匹配的序列；
• 注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。
• 擅用Gene Overlap，比方说加个flag标签，his标签，my标签之类的，直接设计三引物overlap一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。引物长一点不要紧（我最喜欢两步法了），尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候Gene Overlap就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。
• 没有合适的酶切位点？很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1，Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意连上了切不下来），实在不行就平端吧。

3. PCR扩增

如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。目前市面上可选择的PCR酶实在太多，每隔一段时间还会升级，正常情况下，高保真的taq酶都能满足需求。但如果遇到难PCR的高GC基因，可以换不同PCR酶，添加一些 DMSO，甘油等，实在不行可以考虑Clontech的2 GC rich kit，价格和实力都大牛。另外，建议电泳切胶回收纯化PCR产物，去除一些非特异性条带。

4. 酶切

强烈推荐NEB的内切酶，记得有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了（当然当时质粒浓度也不高），而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4。另外TAKARA的酶也还可以。

5. 连接

最常用的是NEB的T4连接酶，很好用，但是注意Buffer里有ATP，反复冻融ATP失活很快，拿到buffer后就分装，10uL/管，一次性使用。

载体总量：一般来说，载体浓度在20-100ng/uL较好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15uL。

载体和插入片段比例：载体和插入片段比例一般是1:7，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高片段浓度，同时加大比例1:10。

6. 转化

按照SOP做就行，话说实验室原来从takara买感受态（competent cell），后来发现还是自己做的效率高（protocol免费索取）。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个技术员，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了kana的LB，直接晕过去了。

7. 鉴定

想要快速鉴定，建议用菌液PCR，菌液PCR是有一定讲究的，很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多，为什么？因为你PCR引物选的都在载体上，注意引物必须分别在载体和插入片段上才准，PCR方法鉴定是极其准确的，数百次菌液PCR经验。PCR鉴定做起来也很简单，拿个2mL tube，装0.5mL 加入相应抗生素的LB，摇个三小时左后取1uL做模板就行了。如果想更快，直接菌落PCR也不错，效果一样。

8. 测序

拿到测序结果时，不仅要核对序列，还要看测序峰图，这很重要。因为有时候光看序列对，实际上图显示的不对，或者虽然序列结果不对，但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信，出现突变也不怕，有很大可能性是简并密码子；

还要重点检查的地方就是“接头”的地方，因为偶尔引物会出错，比方说少个碱基什么的，还有时候酶切之后连接也会丢一两个碱基什么的，如果不仔细检查到了后期悔之无及。